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cck8試劑實驗過程中的疑難解答(二)
點擊次數:562 發布時間:2018-03-22
1.哪些物質會影響cck8試劑的測定?
當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定,例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。
2.在實驗中吸光度值太高,如果不能減少細胞數量,如何解決?
可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。
3.設定參比波長的目的是什么?必須設定嗎?
不一定要設定。cck8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。
4.說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應該加多少量cck8試劑?
一般情況下建議加入cck8試劑的量是培養基體積的1/10。
5.在cck8試劑顯色過程中,如何終止反應?
有一下幾種方法(96孔板): 1、 在顯色反應后,將培養板放置4℃冰箱內。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止后,應在24小時之內測定。
6.必須預培養細胞嗎?
不一定。如果要向保持細胞的zui好狀態,建議預培養細胞。如果不做細胞預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。
7.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?
金屬對cck8試劑顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑制。
8.cck8試劑的保存條件?
在避光條件下cck8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話,推薦在-20℃下保存。但是cck8試劑若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結果,若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。
9.預培養后,更換培養基需要細胞計數嗎?
一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數盤計數,制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。
10.cck8試劑對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?
不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞,一般加入cck8試劑培養1-4小時吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長cck8試劑的加入時間或增加細胞數量來解決。
11.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?
懸浮細胞由于染色比較困那,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。
12.應該每次做標準曲線嗎?
建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣,對于狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對于不同的批號建議分別做標準曲線。
13.有時在藥物作用情況下,細胞已經死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?
不能。由于cck8試劑是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。
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